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01. 什么是通用型iPSCs？
通用型誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）是指經(jīng)過基因編輯處理，能夠降低免疫原性、避免免疫識別與攻擊，從而可適用于異體移植的誘導(dǎo)多能干細胞。此類細胞在異體移植場景中不會引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，具有“現(xiàn)成"可用、經(jīng)濟高效的特點，能夠為大規(guī)模臨床應(yīng)用提供適合的細胞來源，推動再生醫(yī)學(xué)及基因治療技術(shù)的發(fā)展。
人類白細胞抗原（HLA）是細胞表面的關(guān)鍵分子，免疫系統(tǒng)通過其來區(qū)分自身和非自身細胞。在異體移植中，供體與受者的HLA不匹配會引發(fā)免疫排斥反應(yīng)。通用型iPSCs的構(gòu)建需要對HLA分子進行基因編輯，以減少或消除HLA的表達，從而避免免疫系統(tǒng)的識別與攻擊。然而，HLA分子分為I類和II類，占據(jù)基因組的較大區(qū)域，難以通過單一基因編輯策略刪除。研究發(fā)現(xiàn)，敲除β?微球蛋白（β?M）亞基可以有效抑制HLA-I類分子的表達2，而敲除CIITA轉(zhuǎn)錄因子能夠抑制HLA-II類分子的表達3。通過聯(lián)合敲除這兩種基因，可以實現(xiàn)iPSCs中HLA分子的全面抑制。
然而，HLA-I類分子的缺失會導(dǎo)致自然殺傷（NK）細胞的攻擊性顯著增強，因為NK細胞通過識別HLA-I類分子上的特定配體來判斷細胞是否正常。為了逃逸NK細胞的攻擊，部分研究嘗試僅保留HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G等亞類分子4,5，但這樣的iPSCs仍然無法避免免疫排斥反應(yīng)，僅能視為“半通用"細胞。因此，構(gòu)建通用型iPSCs的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于有效地防止NK細胞的攻擊1。近期的研究進展表明，通過抑制NK細胞激活受體（KAR）的配體表達，例如敲除CD155基因并保留HLA-E分子，可以使iPSCs在逃逸NK細胞識別的同時，仍然保留對腫瘤細胞的抑制能力6。然而，NK細胞通過多種KAR與不同的配體結(jié)合，且配體表達水平會因細胞類型而異，這增加了通用型iPSCs構(gòu)建的復(fù)雜性。
02. 蛋白表達篩選驗證基因敲除或敲低的蛋白編碼序列
流式細胞術(shù)和ELISA在檢測細胞內(nèi)蛋白時存在局限性，傳統(tǒng)Western Blot耗時且重復(fù)性差。相比之下，Simple Western技術(shù)的Jess平臺能高效檢測膜結(jié)合蛋白及細胞內(nèi)靶標蛋白，僅需3 µL iPSCs裂解液即可實現(xiàn)可重復(fù)定量分析，并可用于篩選殘留Cas9蛋白，保障工程化iPSCs的安全性。
SW 篩選iPSCs中的HLA以及KAR配體敲除：
利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建了靶向 HLA和KAR配體的基因敲除文庫（表1）。
表 1 iPSCs 中的基因敲低靶標。β?M和CIITA敲除分別抑制HLA-1和HLA-2；BAT3、CD155和MICA為已知KAR配體。CIITA和BAT3為胞內(nèi)定位，其余為表面暴露靶點。
利用SW檢測篩選文庫中的β?M和CIITA低表達的克隆（分別抑制HLA-1和HLA-2）（圖1左）。使用RePlex™模塊通過NIR熒光通道在第二輪檢測總蛋白（圖1右）。類似方法用于篩選KAR配體表達（圖2）。
圖 1 Simple Western 篩選 iPSCs 中的 HLA 敲除。RePlex™ 模塊用于在探針 1（左）中同時檢測 β2M 和 CIITA，在探針 2（右）中通過 NIR 檢測總蛋白。
圖 2 Simple Western 篩選KAR配體敲除iPSCs克隆。RePlex™ 模塊用于在探針 1（左）中同時檢測 BAT3、CD155 和 MICA，在探針 2（右）中通過化學(xué)發(fā)光檢測總蛋白。
圖3 顯示的是以野生型為對照，量化各克隆的敲低百分比，并將流式與Simple Western 進行對比。
圖 3 通過流式及Simple Western敲低靶蛋白的數(shù)據(jù)對比。數(shù)值表示相對于野生型對照的百分比表達量（野生型表達量為100%，敲低為0%）。靶點CIITA和BAT3未在流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)中展示， 可能是由于它們的細胞內(nèi)定位導(dǎo)致流式檢測結(jié)果不可靠。CIITA和BAT3的敲低百分比量化數(shù)據(jù)改在表4中呈現(xiàn)。
Simple Western顯示多數(shù)克隆的靶點敲低率高于流式（圖3，表2）。克隆#7對5個靶點的敲低具有良好效果（除BAT3為69%外，其余均低于野生型50%）。
表 2 Knockdown of intracellular targets that were unreliably detected by flow cytometry were measured by the Simple Western platform. 數(shù)值表示相對于野生型對照的百分比表達量（野生型表達量設(shè)為100%，敲低為0%）
03. 殘留Cas9篩選
CRISPR-Cas9工程化iPSCs需監(jiān)測殘留Cas9，Simple Western檢測顯示所有克隆的Cas9均低于6.4 ng/mL重組對照（圖4）
圖 4 Simple Western 篩選工程 iPSCs 中的殘留 Cas9
經(jīng)基因改造成為通用低免疫原性供體的iPSCs需在蛋白質(zhì)水平進行功能驗證。在此環(huán)節(jié)中，Simple Western技術(shù)相比于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析方法，在以下幾個方面展現(xiàn)出它的優(yōu)勢：
(1) Simple Western儀器可無差別檢測全細胞裂解液、表面蛋白及純化蛋白，全程僅需3小時且無需人工操作。
(2) 傳統(tǒng)Western blot方法可輕松轉(zhuǎn)移至Simple Western平臺。作為毛細管電泳免疫分析，其提供尺寸特異性及抗體靶向檢測，已驗證抗體超5,000種。
(3) Simple Western檢測僅需 3 μL 微量樣本, 無需延長細胞培養(yǎng)。
(4) Simple Western具有高重復(fù)性、高靈敏度及定量分析功能。作為開放式毛細管Western blot技術(shù)平臺，Simple Western用戶可自由選用任何商業(yè)化或定制抗體，實現(xiàn)對目標蛋白及其異構(gòu)體的特異性檢測。
* 參考文獻:
1. Koga K, Wang B, Kaneko S. Current status and future perspectives of HLA-edited induced pluripotent stem cells. Inflamm Regen. 2020 Oct 1;40:23.
2. Riolobos L, Hirata RK, Turtle CJ, Wang PR, Gornalusse GG, Zavajlevski M, Riddell SR, Russell DW. HLA engineering of human pluripotent stem cells. Mol Ther. 2013;21(6):1232–1241.
3. DeSandro A, Nagarajan UM, Boss JM. The bare lymphocyte syndrome: molecular clues to the transcriptional regulation of major histocompatibility complex class II genes. Am J Hum Genet. 1999;65(2):279–286.
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5. Kitano Y, Nishimura S, Kato TM, Ueda A, Takigawa K, Umekage M, Nomura M, Kawakami A, Ogawa H, Xu H, Hotta A, Takasu N, Tsukahara M. Generation of hypoimmunogenic induced pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 system and detailed evaluation for clinical application. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022 May 29;26:15-25.
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